示意文章-1

       在化妝品制造業(yè)持續(xù)不斷發(fā)展的情形下，可用于制作 化妝品的原材料種類不斷增加，化妝品配方使用的 原料數(shù)量也持續(xù)增加，因此化妝品安全風險越來 越高。根據(jù)我國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會（原衛(wèi)生部）化 妝品不良反應(yīng)監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)的資料，化妝品過敏或刺激導致的接 觸性皮炎占到了化妝品皮膚病的90%以上[1]。為盡可能降低化 妝品制作及使用的安全風險，使產(chǎn)品更加溫和, 各大化妝品公 司紛紛在配方中添加植物提取物、活性多肽等抗皮膚過敏的 活性成分，起到預防和舒緩作用。例如，法國宣爾雅化妝品 在配方中添加洋甘菊以提高肌膚免疫防御能力，歐美等國家 將北美金縷梅提取物添加到化妝品中以促進皮膚過敏皮炎修復[2]。值得指出的是，“防敏”、“安全無刺激”、“溫和不刺激” 等詞匯是化妝品備案禁用詞，但是國家食品藥品監(jiān)督管理局 注意到了上述市場變化，監(jiān)管政策將會有所調(diào)整。2020年9月 公布的《化妝品功效宣稱評價指導原則》（征求意見稿）明確了 “宣稱適用于敏感皮膚（肌膚）”、“宣稱溫和（無刺激）”的功 效評價原則，各企業(yè)將在其指導下開展評價試驗和產(chǎn)品研發(fā)。

      化妝品相關(guān)的皮膚過敏反應(yīng)臨床表現(xiàn)多為局部的皮膚 瘙癢、刺痛、紅腫、脫屑、灼熱感、緊繃感等[3]，主要涉及I 型過敏反應(yīng)和IV型過敏反應(yīng)兩類，其反應(yīng)原理如圖1、圖2所示。I型過敏反應(yīng)是指已致敏的機體再次接觸相同抗原后在數(shù) 分鐘內(nèi)所發(fā)生的超敏反應(yīng)，其主要特點是發(fā)生快、消退也快， 通常只是導致機體生理功能紊亂，極少引起組織損傷。IV型 過敏反應(yīng)是由致敏T細胞與相應(yīng)抗原作用后，引起的以單個核 細胞浸潤和組織細胞損傷為主要特征的炎癥反應(yīng)。已有研究 表明，無論是針對I型過敏反應(yīng)，還是IV型過敏反應(yīng)，抗敏活 性物的作用機制都主要通過抑制過敏介質(zhì)在過敏反應(yīng)過程中 的釋放，或者拮抗過敏介質(zhì)的作用產(chǎn)生抗過敏效果[4]。

       目前，針對抗敏性活性物的抗敏性測定研究較多，其 包括體外實驗、動物試驗、細胞試驗以及人體試驗，但大多 數(shù)研究只是綜述抗敏測定方法以及從功效方面比較抗敏測定 方法，而從過敏反應(yīng)機理上綜述抗敏測定方法的研究較少。 因此，本文從過敏介質(zhì)的角度，分類綜述了近年來化妝品抗 敏安全性評價模型的研究進展，以期為抗過敏原料的篩選和 溫和化妝品的研究開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 組胺為靶點的測評模型

      組胺是通過組氨酸脫羧酶，由L-組氨酸合成的一種低分 子量胺，組氨酸脫羧酶是一種在全身表達的酶，包括肥大 細胞、胃壁細胞和中樞神經(jīng)系統(tǒng)。組胺是I型過敏反應(yīng)的重 要介質(zhì)，從抗原與肥大細胞表面上的IgE抗體相互作用中釋 放，具有許多重要的生理作用，可引起毛細血管擴張及通透 性增加、平滑肌痙攣以及分泌活動增強等，臨床上導致局部 充血、水腫[5]，其作用機理圖如圖3[6]所示，它可直接刺激皮 膚，導致皮膚出現(xiàn)過敏現(xiàn)象。

組胺的多種生物學效應(yīng)是通過4種類型的組胺受體介導 的， 即H1受 體（H1R）、H2受 體（H2R）、H3受 體（H3R） 和H4受體（H4R）（圖3）[7]。而與皮膚過敏有關(guān)的是H1R和 H4R受體。H1R激活介導了許多I型過敏反應(yīng)癥狀，包括瘙 癢、紅斑和水腫。實際上，H1R拮抗劑已用于這些過敏癥狀 的局部和全身治療[8]。H4R參與過敏性疾病的發(fā)生也已被證 實。例如，與H1R和H4R拮抗劑聯(lián)合治療可防止花生過敏實 驗模型中腹瀉和腸道炎癥的發(fā)生；在過敏性皮炎的實驗模型 中，與野生型小鼠相比，H4R敲除小鼠的皮膚病變更少，盡 管在致敏和激發(fā)過程中都需要對H4R進行藥理學阻斷才能部 分模擬在H4R敲除小鼠中觀察到的結(jié)果[9]。

       目前已有大量針對抑制組胺的抗過敏化妝品原料上 市，如德國SYMRISE公司的Symcalmin?德敏舒、青海湖 藥業(yè)的甘草酸二鉀以及法 國SEQENS（艾比 歐）公司的 Sens’flower? SD-SC藏紅花舒敏因子、浙江湃肽生物有限 公司的ZPC?Anti-allergy074S抗敏修復肽原液等，這些原料 都被宣稱對組胺引起的刺激有良好的抑制作用。因此，抑制 組胺釋放是抗敏功效化妝品的直接手段，而以組胺為靶點的 測評模型比較多，涉及到生化反應(yīng)、細胞實驗、動物實驗以 及人體實驗等方面，例如以組胺H3R為靶點的細胞實驗[10]和 以H1R和H4R為雙靶點的動物實驗[11, 12]。

  1.1 透明質(zhì)酸酶抑制模型

       研究發(fā)現(xiàn)，肥大細胞釋放的組胺可導致透明質(zhì)酸酶活 性的增加，組胺的釋放量就越高，透明質(zhì)酸酶活性就越高， 過敏反應(yīng)也就越強烈[13]。因此，透明質(zhì)酸酶活性抑制和肥大 細胞釋放組胺抑制活性之間具有很好的相關(guān)性，通常用透明 質(zhì)酸酶體外抑制模型來測定抗敏性。近年來，國外學者對透 明質(zhì)酸酶抑制模型進行了大量研究，生物堿、多酚、類黃酮

（芹黃素，木犀草素，槲皮素，山奈酚和蘆?。┖洼祁惢?物都已被證明具有透明質(zhì)酸酶抑制性[14-16]。國內(nèi)學者也進行 了一系列研究，王領(lǐng)[17]用透明質(zhì)酸酶體外抑制模型篩選了仙 人掌提取物等10種提取物，發(fā)現(xiàn)仙人掌、馬齒莧、苦參提取 物在同等濃度下具有很好的抗敏功效；劉超[18]研究了中藥射 干中鳶尾苷的抗透明質(zhì)酸酶作用，發(fā)現(xiàn)鳶尾苷純化物II具有 良好的抑制透明質(zhì)酸酶作用，表明鳶尾苷具有良好的抗致敏 性。這些研究表明透明質(zhì)酸酶抑制率是用作評估物質(zhì)抗敏功 效的有效指標。

  1.2 以組胺為靶點的細胞實驗

      以組胺為靶點的細胞實驗較多，有大鼠腹膜肥大細胞脫顆粒模型以及二甲苯小鼠耳腫脹實驗模型。大鼠腹膜肥大 細胞脫顆粒模型是模擬肥大細胞釋放組胺過程，通過在大鼠 腹腔給藥后分離腹腔肥大細胞，細胞染色后在顯微鏡下觀察 明顯脫顆粒細胞的百分數(shù)來表征藥物抗敏功效。ASHWINI 等[19]利用大鼠腹膜肥大細胞脫顆粒模型研究了多草藥制劑 Bresol?對肥大細胞脫粒和肥大細胞中組胺釋放的保護作用， 評估了Bresol?對化合物48/80誘導的肥大細胞脫粒和組胺從 大鼠腹膜肥大細胞釋放的肥大細胞穩(wěn)定作用，發(fā)現(xiàn)其制備的 草藥復方制劑Bresol?對肥大細胞脫粒和肥大細胞中組胺釋 放的保護作用可有效抑制化合物48/80誘導的組胺釋放。二 甲苯誘導的小鼠耳腫脹模型主要通過促進組胺等炎性介質(zhì)的 釋放，刺激局部毛細血管擴張和炎性細胞浸潤加重，引起耳 部出現(xiàn)急性滲出性水腫。張志紅等[20]使用二甲苯小鼠耳腫脹 實驗模型研究了秦艽及秦艽不同配伍對炎癥早期實驗性滲 出、腫脹的影響，發(fā)現(xiàn)秦艽配伍制川烏組、秦艽配伍桑寄生 組的小鼠耳廓腫脹度均顯著降低。因此，動物實驗是最廣泛 使用的抗過敏功效評估方法，然而動物實驗過程相對繁瑣， 且歐盟2013年起禁止使用動物進行化妝品原料評價，所以并 不常用于化妝品中有效成分的研究。

   1.3 組胺人體刺激實驗模型

       組胺人體刺激實驗模型是將鹽酸組胺施加于人體皮膚 表面，待皮膚刺激產(chǎn)生泛紅、水皰、瘙癢后，再涂抹抗過敏 成分，觀察紅斑、瘙癢的消退情況。SYMRISE公司采用特 定的試驗刀片在皮膚試驗部位滴加鹽酸組胺(10 mg/mL)，待 皮膚產(chǎn)生水皰及癢感，應(yīng)用試驗產(chǎn)品(2 mg/cm2)，在應(yīng)用試 驗產(chǎn)品后的30、60、90、120、150 min后測定試驗部位的瘙 癢感、紅腫度及水皰面積，實驗結(jié)果顯示SymCalmin?德敏 舒可明顯減輕由組胺引起的皮膚異常狀況，如瘙癢、紅腫及 水皰，并且存在劑量依賴性。盡管個體之間的差異會導致實 驗存在差異，但是每個個體對皮膚的敏感程度不同，并且皮 膚對產(chǎn)品的反應(yīng)方式將決定他們是否繼續(xù)使用該產(chǎn)品，所以 仍然認為人體試驗是有價值的評估方法[21]。

2.1 UVB 致細胞光損傷模型

        UVB照射可引起皮膚發(fā)生急性炎癥，表皮角質(zhì)形成細 胞經(jīng)UVB直接刺激后，會釋放大量炎性介質(zhì)，使毛細血管 擴張，即皮膚出現(xiàn)紅斑[24]。在此過程中，COX-2對于炎癥 的發(fā)生具有重要影響，它是環(huán)氧化酶的一種亞型，是分解 AA生成各種內(nèi)源性前列腺素（PGE2）過程中的關(guān)鍵限速 酶，其可引起受損部位炎性因子前列腺素（PGE2）合成 和聚積[25]，促進炎癥反應(yīng)和組織損傷。因此，COX-2可作 為研究皮膚炎癥反應(yīng)的一個有研究價值的指標。UVB致細 胞光損傷模型是培養(yǎng)表皮角化細胞，用不同劑量UVB照射 細胞致其損傷，然后檢測UVB受損細胞中各過敏介質(zhì)的含 量。卓金士[26]研究了UVB致細胞光損傷模型，發(fā)現(xiàn)虎仗苷 降低了UVB損傷模型中凋亡基因和炎癥基因的表達，如降 低了p53、caspase-3、baxmRNA的表達，抑制了IL-6，IL-18 等炎癥基因的表達，同時還降低了基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-1 的表達。IRB公司預先用不同濃度的GPI處理人表皮角化細 胞24 h，后將細胞暴露于UVB (25 mJ/cm2)的照射下，測定 前列腺素PGE2的分泌水平，發(fā)現(xiàn)GPI能顯著抑制表皮角化 細胞中由UVB引發(fā)的前列腺素PGE2分泌，緩解炎癥反應(yīng)。 何詠[27]研究了矢車菊素-3-葡萄糖干預UVB損傷HaCaT細胞 ROS/COX-2通路，發(fā)現(xiàn)UVB通過誘導ROS的產(chǎn)生增多，激 活EFGR，從而促進ERK、p38、JNK和Akt的磷酸化，調(diào)節(jié) COX-2的表達，減少炎性因子前列腺素（PGE2）的合成， 從而減少皮膚紅斑。

2.2 AA 誘導小鼠耳腫脹模型

     AA誘導小鼠耳腫脹模型被廣泛使用，其主要被白三烯 和其他脂肪氧化酶介導，而在白三烯存在的情況下前列腺 素（PGE2）會更促進小鼠耳腫脹[28]。黎麗等[29]利用AA誘導 小鼠耳腫脹模型研究了角蒿咖啡酸酯的抗敏功效，發(fā)現(xiàn)其能 顯著抑制AA所致的小鼠耳腫脹程度和組織蛋白滲出量，并 降低小鼠發(fā)炎耳組織中白三烯B4的生成量。BHAT等[30]通過 動物實驗證實白藜蘆醇可以抑制COX-1而致PGE2合成減少， 對小鼠炎癥模型具有良好抗炎作用。曹雯[31]通過建立花生四 烯酸誘導的小鼠耳腫脹模型，研究了THCA354化合物抑制 花生四烯酸誘導的急性炎癥反應(yīng)，結(jié)果表明實驗組和陽性對 照組均能有效地抑制小鼠耳腫脹。

2.3 AA 誘導的血小板聚集模型

       AA誘導的血小板活化因子（PAF）為一種血小板聚集 激活劑，可促進血栓形成，誘發(fā)炎癥反應(yīng)[32]。PAF介導的血 小板聚集模型的機制是PAF介導下致血小板凝聚現(xiàn)象。臧寶 霞等[33]發(fā)現(xiàn)紅花活血化瘀的有效部位羥基紅花黃色素A以及 楊梅素均為抗PAF的有效成分，可抑制PAF與兔血小板受體 的特異性結(jié)合，明顯抑制了PAF誘發(fā)的血小板黏附。

3 IgE為靶點的測評模型

IgE是由B淋巴細胞產(chǎn)生的分子量為190 kD的免疫球蛋 白，是過敏反應(yīng)的主要參與者，其活性與蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)有關(guān)， 其結(jié)構(gòu)示意圖見圖5[34]。IgE有2種受體：在B細胞以及其他造 血細胞表面表達的低親和力IgE受體（FcεRII，CD23）和高親 和力IgE受體（FcεRI）。FcεRI在肥大細胞和嗜堿性粒細胞 上以四聚體（αβγ2）的形式表達，并在抗原呈遞細胞上以三 聚體（αγ2）的形式表達。人嗜堿性粒細胞FcεRI表達的密度 與血清IgE水平直接相關(guān)，其中IgE的結(jié)合穩(wěn)定了細胞表面的 受體，F(xiàn)cεRI亞基沒有已知的酶活性，而是通過相關(guān)的細胞 質(zhì)酪氨酸激酶發(fā)出信號[35]。已有大量證據(jù)表明，IgE和肥大 細胞也是哮喘和其他環(huán)境中的慢性過敏性炎癥相關(guān)的長期病 理生理變化和組織重塑的關(guān)鍵驅(qū)動力。這些潛在的作用包括 肥大細胞功能的IgE依賴性調(diào)節(jié)，很大程度上獨立于肥大細 胞的IgE的作用以及不直接涉及IgE的肥大細胞的作用[36]。因 此，以IgE信號通路為靶點設(shè)計藥物，阻斷IgE與其高親和力 受體(Fc)的結(jié)合及下游信號傳遞是目前變態(tài)反應(yīng)性疾病藥物 研究的熱點。

       Kelly等[37]研究表明通過FcεRI激活肥大細胞是過敏性疾病 發(fā)病機理的關(guān)鍵，導致皮膚紅斑、浮腫和瘙癢，可以通過皮 膚測試或血清中過敏原特異性IgE的測定來確定。易斌等[38]采 用HITACHI 7170A全自動生化分析儀對檢測1 100例過敏性 皮膚病患者血清總IgE值，研究發(fā)現(xiàn)53%的過敏性皮膚病患 者血清總IgE升高，其中以濕疹和接觸性皮炎最為明顯，表 明血清IgE在大多過敏性皮膚病的發(fā)生、發(fā)展中起到一定的 推動作用。王永奇等[39]以IgE為活性指標研究了金花茶組植 物抗IgE介導I型過敏反應(yīng)的活性，結(jié)果表明金花茶組植物 均能明顯降低大鼠血清IgE和LT的含量，明顯減少全血中的 EOS數(shù)量，減小肺組織炎癥面積。青海湖藥業(yè)分別用甘草 酸和甘草次酸處理組胺激發(fā)下的小白鼠巨噬細胞，通過測 量IgE值，發(fā)現(xiàn)甘草酸在1 mg/mL濃度下抑制效果可以達到 83.4%，明顯優(yōu)于甘草次酸。

4 細胞因子為靶點的測評模型

     細胞因子是由免疫細胞分泌的多肽或者糖蛋白，受到 NF-κB信號通路調(diào)控，通過與特異性受體結(jié)合作用于靶細胞而 發(fā)揮生物學作用[40]，其在IV型過敏反應(yīng)中起關(guān)鍵作用（圖2）。 主要類別有腫瘤壞死因子：TNF-α、TNF-β，白細胞介素： IL-1α、IL-6、IL-8，集落刺激因子G-CSF、GM-CSF等。

4.1 TNF-α 刺激的角質(zhì)形成細胞模型

     角質(zhì)形成細胞既可產(chǎn)生多種細胞因子，又是多種細胞 因子作用的靶細胞，在皮膚免疫反應(yīng)中有重要意義。何榮安 等[41]將終濃度為10 ng/mL的TNF-α加入到細胞培養(yǎng)基中，聯(lián) 合20 μmol/L瑞香素處理，發(fā)現(xiàn)能減弱TNF-α刺激角質(zhì)形成 細胞所引起的炎癥因子表達升高。胡惠清等[42]采用酶聯(lián)免疫 吸附試驗（ELISA）發(fā)現(xiàn)蛻皮甾酮對TNF-α刺激角質(zhì)形成細胞后炎癥因子的產(chǎn)生有抑制作用。

4.2 脂多糖（LSP）誘導 RAW264.7 巨噬細胞模型

    脂多糖（LSP）是最常見且危害性最大的一種致炎因 子，由親水性的O-特異性抗原多糖、類脂A、核心多糖及 特異性側(cè)鏈四部分所組成，其中類脂A由葡糖胺、磷酸鹽及 脂肪酸組成，是LSP的毒性中心和主要生物活性部分。LSP 作用于RAW264.7誘導炎癥反應(yīng)的機制是，形成LSP-LBP- SCD14復合體作用于TLR4，并激活NF-κB和MAPKs信號通 路，誘導的RAW264.7巨噬細胞中iNOS和COX-2的mRNA表 達，促進炎性基因iNOS，COX-2的轉(zhuǎn)錄，增加促炎性細胞 因子如TNF-α，IL-6和IL-1β的釋放[43]。姚茹[44]建立了LPS 誘導的RAW264.7巨噬細胞模型，采用蓮心堿預處理后可顯 著降低TNF-α，IL-6和IL-1β的含量，進一步提示蓮心堿的 抗炎作用。汪娟等[45]在脂多糖刺激的巨噬細胞模型上，篩選 分離降香活性化合物，得到的活性化合物能抑制脂多糖誘導 RAW264.7分泌的細胞因子TNF-α的釋放。

4.3 佛波酯（TPA）致小鼠耳腫脹模型

   TPA致小鼠耳腫脹模型的主要機能誘導小鼠耳組織角 質(zhì)形成細胞產(chǎn)生TNF-α，IL-1β等炎癥細胞因子。TNF-α 的存在會促進繼發(fā)性炎癥細胞因子生成，促使炎癥反應(yīng)進 一步擴大，繼而刺激磷脂酶誘導AA釋放，代謝成為PGE2和 LTB4，促進組胺和5-羥色胺的釋放，加重炎癥。何勤敏[46]利 用TPA致小鼠耳腫脹模型發(fā)現(xiàn)屏邊三七總皂苷可抑制炎癥介 質(zhì)NO、PGE2、TNF-α的分泌，顯著降低TPA誘導的小鼠的 耳組織的水腫、毛細血管擴張和炎性細胞浸潤現(xiàn)象。彭奕[47] 通過TPA誘導的小鼠耳廓腫脹模型，評價了活性酵母細胞代 謝物的抗炎活性及機理研究，研究發(fā)現(xiàn)，活性酵母細胞代 謝物可明顯抑制TPA誘導的小鼠耳廓角質(zhì)層增厚和炎癥因子 COX-2的表達及NF-кB通路的活化，其抑制率高達54.46%。

5 辣椒素受體（TRPV1）通路為靶點的測評模型

辣椒素受體（TRPV1）廣泛分布于哺乳動物的感覺神 經(jīng)纖維，是一種非選擇性的陽離子通道[48]。TRPV1被激活 時，能引起Ca2+、Mg2+和Na+等陽離子內(nèi)流，但對Ca2+和Mg2+ 有相對選擇特異性，TRPV1激活后使胞內(nèi)陽離子濃度升高， 引起相應(yīng)的生理和病理變化（圖6）[49]。TRPV1可以被多種 神經(jīng)炎癥介質(zhì)和內(nèi)源性炎癥介質(zhì)如緩激肽、P物質(zhì)、前列腺 素、神經(jīng)生長因子和降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)等直接或間接激活[50]。CGRP是第一個通過基因重組和生物合成的神經(jīng) 多肽，由37個氨基酸組成，TRPV1是調(diào)節(jié)CGRP合成與釋放 的關(guān)鍵受體。

5.1 辣椒素誘導的小鼠耳水腫模型

       辣椒素誘導的小鼠耳水腫模型是將一定劑量的辣椒素 注射到小鼠耳朵，在降鈣素基因相關(guān)肽、P物質(zhì)、神經(jīng)激肽 A和血管活性腸肽等神經(jīng)肽介導下發(fā)生腫脹。SARAIVA等[51] 利用辣椒素誘導的小鼠耳水腫模型評估果皮提取物的局部抗 炎作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其能夠減輕小鼠耳朵的水腫。

5.2 辣椒素人體刺激實驗模型

     辣椒素人體刺激實驗模型是將辣椒素和待測樣品混合 施加于人體皮膚表面，觀察皮膚刺痛、灼熱及消退情況。 SYMRISE公司將含有31.6 mg/kg辣椒素和1%活性物的水包油 乳液涂抹在志愿者鼻唇溝位置，與只含辣椒素的樣品對照， 發(fā)現(xiàn)1%活性物能顯著降低辣椒素引起的刺痛和灼熱感。

6 其他測評模型

《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015版）第7章提供了人體皮 膚斑貼實驗、人體試用試驗安全性評價的方法，以檢測受試 物引起人體皮膚不良反應(yīng)的潛在可能性。另外，還可通過測 量志愿者使用產(chǎn)品前后皮膚生理功能指標，如經(jīng)皮水分丟失 TEWL、含水量、pH值、Lab值等，對于評價和驗證抗過敏 原料和化妝品對于人體的實際效果有重要參考意義[52]。

7 結(jié)束語

近些年，由于生態(tài)環(huán)境惡化、各類工業(yè)添加劑濫用等 原因，許多人皮膚處于亞健康狀態(tài)，表現(xiàn)為皮膚耐受力低 下，易受到各種物理化學因素的刺激過敏而產(chǎn)生刺痛、燒 灼、緊繃、瘙癢等感覺。在化妝品中添加抗敏活性成分，盡 可能避免化妝品原料因素帶來的不利影響，降低對上述人群

肌膚的刺激具有重要意義，而這也越來越受到研發(fā)工程師和 消費人群的重視。因此，深入探索過敏反應(yīng)機理，尋找合適 的抗敏安全性測評方法對于抗敏化妝品原料的篩選以及化妝 品研發(fā)體系具有重要意義，將促進化妝品行業(yè)的發(fā)展。